Injection virale stéréotaxique pour l’édition de gènes neuronaux ciblés dans le cerveau de souris

Résumé

Source : Fricano-Kugler, C. J., et al. Conception, emballage et administration de CRISPR retro et de lentivirus à titre élevé par injection stéréotaxique. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre l’injection virale stéréotaxique pour une édition précise des gènes neuronaux dans le cerveau de la souris. Le protocole garantit une livraison précise du virus au gyrus denté, permettant le marquage fluorescent et l’inactivation de gènes médiée par CRISPR pour étudier les circuits neuronaux, la fonction des gènes et les mécanismes de la maladie in vivo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection stéréotaxique

1. Confirmez que la ventilation de la salle d’opération est ouverte pour assurer une bonne circulation de l’air. Préparez la souris à la chirurgie en l’anesthésant avec de l’isoflurane à 4 % dans une chambre d’induction. Après l’anesthésie, rasez la tête pour préparer le site d’injection.
   1. Place la souris dans l’instrument stéréotaxique en utilisant une pince à épiler pour déplacer la langue vers le bas et sur le côté. Insérez la barre d’occlusion dans la bouche jusqu’à ce que les dents tombent dans la fente, puis fixez les barres d’oreille. Assurez-vous que le corps de la souris est sur le coussin chauffant et que le nez est situé dans le cône nasal. Dirigez l’isoflurane à 4 % dans le cône nasal. Confirmez l’anesthésie en pinçant le pied avec une pince à épiler et en vous assurant qu’il n’y a pas de réflexe de sursaut.
   2. Appliquez des larmes artificielles pour lubrifier les yeux. Terminez la préparation du site d’injection en frottant la tête rasée avec une alternance de doses de povidone iodée et de lidocaïne.
2. À l’aide d’un scalpel, faites une petite incision au centre du cuir chevelu. Séchez le crâne avec un écouvillon et du peroxyde d’hydrogène si nécessaire pour aider à visualiser le bregma.
   1. À l’aide d’une lunette de dissection, localisez le bregma sur le crâne et placez la pointe de la perceuse sur le bregma. Zéro (ou enregistrez) les coordonnées stéréotaxiques numériques sur les plans x, y et z.
   2. Afin de s’assurer que la tête est de niveau sur l’axe des y rostral à caudal, placez le foret sur lambda et nivelez la tête de sorte que la coordonnée z soit à peu près égale à la fois au bregma et au lambda.
   3. Afin de s’assurer que la tête est de niveau sur l’axe des x, placez le foret à y = 1/2 lambda. Assurez-vous que la coordonnée z est égale à 1 mm de chaque côté (x = +/-1 mm) de la suture sagittale. Ajustez le crâne s’il y a une différence dans la coordonnée z à 1 mm à gauche et à droite de lambda.
3. Placez la perceuse sur les coordonnées souhaitées. Pour le gyrus denté, utilisez les coordonnées y = -1,9 de bregma et x = +/- 1,1. Avant de percer, abaissez l’isoflurane à 2 %, puis percez lentement et soigneusement le crâne.
   1. Après avoir percé tous les trous, fixez la seringue remplie sur l’instrument stéréotaxique. Centrez visuellement la seringue sur le trou et mettez à zéro la coordonnée z au niveau du crâne.
   2. Abaissez lentement la seringue jusqu’à la profondeur z la plus profonde. Pour le gyrus denté, les profondeurs z sont -2,5, -2,4 et -2,3. Commencer l’injection à un débit de 0,25 μl/min à l’aide d’un injecteur stéréotaxique.
      1. Une fois l’injection terminée à la profondeur Z la plus basse, attendez 1 min, puis augmentez jusqu’à la coordonnée suivante et recommencez l’injection. Continuez ce schéma jusqu’à ce que toutes les coordonnées d’injection z soient injectées. Attendre 2 min avant de retirer la seringue après la dernière injection.
         REMARQUE : Aucun effet indésirable n’a été noté sur les tissus lors de l’injection de jusqu’à 2 μl de virus par hémisphère dans le cerveau de la souris.
   3. Injection répétée pour d’autres forages.
4. Après l’injection, retirez la souris de l’instrument stéréotaxique et suturez le cuir chevelu avec des sutures en soie 6-0. Appliquez de la lidocaïne et une crème antibactérienne sur la plaie.
   1. Injectez 0,8-1,0 ml de solution saline + kétoprofène (3-5 mg/kg) par voie intrapéritonéale (I.P.) pour gérer la douleur. Ensuite, placez la souris dans la chambre de récupération chauffée. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas l’animal en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Vet-Seringue vétérinaire utilisation vétérinaire T.B. Seringue uniquement 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Lames de scalpel en acier inoxydable, #10, pqt de 100	Med-Vet International	JOR580S
Pommade pour larmes artificielles	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Saline normale	Med-Vet International	DYND500MLSH
Applicateurs à embout en coton	Med-Vet International	CTA6
Pommade antibiotique triple	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Aiguilles Soft Pack 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 sutures en soie	Med-Vet International	MV-711

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